PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒*啦

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Calcein-AM是一種對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490nm, Em=515nm）。因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團(tuán)，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein, AM細(xì)胞毒性極低，是適合用于活細(xì)胞染色的熒光探針，而且不會(huì)抑制任何的細(xì)胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細(xì)胞的細(xì)胞生存能力測試和短期標(biāo)記。因此，Calcein-AM常常與死細(xì)胞熒光探針如碘化丙啶（PI）等聯(lián)合使用，同時(shí)進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光雙重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，僅能穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI僅對死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。而用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。

本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料，來進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色標(biāo)記，從而進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)體系，單次就200µl細(xì)胞懸液進(jìn)行染色，分別可以做500次和1000次檢測。

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產(chǎn)品組分

運(yùn)輸和保存方法

其中A組分和B組分需-20℃避光干燥保存，C組分-20℃保存，經(jīng)常使用可放在4℃保存。一年有效。

使用方法

1. 工作液的配制

1.1  1×Assay Buffer（反應(yīng)緩沖液）的配制

從低溫冰箱內(nèi)取出10×Assay Buffer，根據(jù)單次用量無菌條件取出適量，用去離子水（dH₂O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。

1.2  1×染色工作液的配制

1）先將低溫保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液（1.5 mM）回到室溫20-30min。

【注意】：次使用可對母液進(jìn)行分裝，以減少反復(fù)凍融次數(shù)。

2）取5µl Calcein-AM溶液 (2 mM)和15µl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混勻。此時(shí)得到Calcein-AM的工作液濃度為2μM，PI的工作液濃度為4.5μM。由于不同細(xì)胞系的佳染色條件不同，初次實(shí)驗(yàn)建議做梯度實(shí)驗(yàn)，以確定 Calcein-AM和PI的適濃度。梯度篩選的原則為使用低的探針濃度得到好的熒光結(jié)果。

【注意】：由于Calcein-AM的穩(wěn)定性比較差，此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當(dāng)天用完。

2. 染色步驟

2.1 對于貼壁細(xì)胞，先用細(xì)胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細(xì)胞，之后離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3min）。

對于懸浮細(xì)胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細(xì)胞。

2.2 去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細(xì)胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

2.3 用1×Assay Buffer制備細(xì)胞懸液，使其密度為1×10⁵~1×10⁶細(xì)胞/ml。

2.4 取100µl染色工作液加入200µl細(xì)胞懸液內(nèi)，混勻，37℃孵育15min。

【注意】：如果需要，可延長孵育時(shí)間至30min。

2.5 熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發(fā)濾片同時(shí)檢測活細(xì)胞（黃綠色熒光）以及死細(xì)胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細(xì)胞。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適的濾片進(jìn)行檢測。

【注意】：可以使用以下方法來優(yōu)化得到兩種熒光染料的佳工作濃度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地gao辛孵育細(xì)胞10min，或者用70%乙醇孵育細(xì)胞30min，從而制備死細(xì)胞；

b) 用0.1-10µM的PI溶液進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到僅僅對細(xì)胞核染色，而不會(huì)對細(xì)胞質(zhì)染色的佳工作濃度。

c) 用0.1-10µM的Calcein-AM進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到不會(huì)對細(xì)胞質(zhì)染色的佳工作濃度。然后用此濃度進(jìn)行活細(xì)胞染色，去觀察是否活細(xì)胞能被染色。

注意事項(xiàng)

1）由于Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時(shí)一定要注意防護(hù)。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清洗。

3）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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