一：
WB實(shí)驗(yàn)代測(cè)的優(yōu)勢(shì)：
下面我們就做WB實(shí)驗(yàn)代測(cè)的原理以及大致需要的操作做了一個(gè)匯總。
1、western免疫印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。
2、與southern或northern雜交方法類(lèi)似，但western免疫印跡采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。
3、經(jīng)過(guò)page分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。
4、以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
二：WB實(shí)驗(yàn)代測(cè)的操作步驟：
1、蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過(guò)電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
2、WesternBlot實(shí)驗(yàn)電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。
3、WesternBlot實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）
4、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡。
5、膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。
6、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、標(biāo)準(zhǔn)層濾紙、NC膜、凝膠、標(biāo)準(zhǔn)層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜準(zhǔn)確對(duì)齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。
7、接通電源，恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開(kāi)電源將膜取出，割取待測(cè)膜條做免疫印跡實(shí)驗(yàn)。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后。
8、在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對(duì)比。
總結(jié)：實(shí)驗(yàn)代測(cè)中的優(yōu)勢(shì)及操作步驟，看完本文您就應(yīng)該有了基本的認(rèn)識(shí)和了解相信大家都明白了吧！總的來(lái)說(shuō)，希望對(duì)大家有所幫助。
您的位置：
更新時(shí)間：2020-08-19 
瀏覽次數(shù)：1758
